РАДИОПРОТЕКТИВЕН ЕФЕКТ НА ПОЛИФЕНОЛИТЕ ОТ КРЪВЕН ЗДРАВЕЦ /GERANIUM SANGUINEUM - L/

Георги Велев, Ст. Иванчева ¹, Р Лазаров ²

Ботанически институт при БАН, Клиника по радиология при НОЦ. Antiradiation effect of poliphenols from Geranium sanguineum - L. G. Velev, St. Ivancheva R. Lazarov ².

Botanical Institute Bulgarien Academy of Sciences, Department of radiology of NOC.

Използването на биологично активни вещества от натурални продукти дава нови възможности на съвременната фармакология. А имено, да създава алтернатива на синтетичните препарати, които обикновено са много токсични. Известни са синтетични радиопротектори като WR- 2721, ОК-78 /5/. Не случaйно в аптеките в САЩ над 70% от предлаганите препарати са с природен произход. Защитата на човешкия и животинските организми от йонизиращите лъчения интересува учените още с откриването им. Радиомодифициращият ефект на редица природни продукти е предмет на изследване на много автори./1,2,3,4/. Тези препарати влизат в съображение за масова профилактика на хора, работещи в среда с йонизиращи лъчения.

GSе лиофилен субстрат на извлек от коренищата на Кръвен здравец /GeraniumSanguineum- L/. Той представлява комплекс от полифенолни съединения със следното процентно съотношение между компонентите: танини /20-30%/, флавоноди /0.03-0.08%/, катехини и пронтоцианидини /0.15-0.25%/, полифенолни киселини /0.01-0.02%/ и баластни вещества/7/.Получаването на извлека става, след като корените се изсушават добре до 12 % влажност, смилат се ситно до големина на частицата 0.5 мм и се провежда екстракция с етилов алкохол. Поради факта, че биологично активните съставки са термолабилни, изсушаването става чрез лиофилизация при температура 35-40°С. Получената субстанция е прахообразна с кафяво-червеникав цвят и се разтваря добре във вода и алкохол.

Задача на настоящото изследване е оценка радиопротекторните възможности на полифенолите , съдържащи се в стандартния препарат GS, получен от корените на кръвен здравец. За постигане на целта е използвана стандартна радиобиологична методика за преживяемост на гризачи, изследване на левкоцити, гранулоцити лимфоцити и тромбоцити в периферна кръв на плъхове, фагоцитарна активност на неутрофили, изследване на основни клетъчни популации при онкологично болни, на които се провежда лъчетерапия.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

1. Опитни животни

Опитите за преживяемост, ендогенни далачни колонии / Е - КОЕ g/ и фагоциторна активност на неутрофили бяха проведени с бели безпородни мишки от мъжки пол с телесна маса 20-25 g. Изледването по отношение на периферни кръвни показатели бе извършено с плъхове порода "Вистар", от мъжки пол, с телесна маса 150 -170 g.

Клинично изпитание на GSсе проведе в НОЦ при онкоболни , на които се провежда лъчетерапия. Групата се състоеше от 12 души, а контролата от 11.

1. Прилагане на препарата.

На опитните мишки се въвеждаше воден разтвор на лиофилизата чрез метална сонда в дози 30 mg/kgтелесна маса 5 поредни дни преди облъчването. На плъховете беше прилаган също чрез метална сонда, но в дози 5 mg/kgтелесна маса. Онкоболните пациенти го приемаха perosпод формата на капсули на гладно по 150 mgна ден /~2.5 mg/kg/, започвайки 10 дни преди началото на облъчванията и продължавайки през целия курс на лечение.

Облъчване. Мишките бяха облъчени с 10 Gyв гама - облъчвател "Лъч -

1300" с четири източника, 60Coи мощност 1.3 u/мин. Плъховете "Вистар" бяха облъчени с 4 Gyв същия гама - облъчвател.

При онкопациентите бе проведен курс на лечение с йонизиращи лъчения в конвенционални дози и обем.

ЕКСПЕРИМЕНТИ И ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ГРУПИ

В проследяването на преживяемост на мишки, облъчени остро с 10 Gyгама - лъчи използвахме четири групи по 20 експериментални животни.

Първа група поихме с разтвор от GSв доза 30mg/kgс помощта на метална сонда пет поредни дни преди облъчването. Профилактична схема на приложение.

Втора група приемаше същата доза пет поредни дни, но след облъчването. Терапевтична схема на приложение.

Двете контролни групи поихме с дестилирана вода - едната преди, другата след облъчването- паралелно с опитните групи.

Проследяване на кръвни показатели в динамика извършихме при две групи плъхове порода "Вистар", като едната поихме с разтвор от лиофилизата GSпет поредни дни преди облъчването с 4 Gyгама лъчи с дози 5 mg/kgтелесна маса, а контролата - с дестилирана вода. Проследихме левкоцити, гранулоцити и лимфоцити. Проследихме в динамика и тромбоцити.

Онкоболните, при които проследихме основните левкоцитни популации, прилагайки им лъчетерапия и приемайки като радиопротектор GSбяха 12. Средната им възраст бе 47.3 год. - 6 мъже и 6 жени. По нозологичнии единици бяха разпределени както следва: четирима пациента провеждаха лечение по повод болест на Ходжкин, четирима - по повод тумори на матката, един - на ректума, един - на белия дроб, един - на назофаринкса, един - на мозъка. В контролната група четирима от пациентите бяха с болест на Ходжкин, двама - с неходжкинови лимфоми, двама - с тумор на езика, един - на назофаринкса, един - с тумор на матката, един - с тумор на гърдата. Или общо контролната група бе единадесет пациента, подложени само на лъчетерапия.

МЕТОДИ

• Преживяемост

Проследихме преживяемост при мишки на 3-^™ , 70-^™ 16-™ , 23-™ , 30-™ ден след облъчването с 10 Gyгама - лъчи, при профлактична и терапевтична схема на приложение на GS.

• Ендогенни далачни колонии / Е - КОЕ g/ определяхме по метода на J.Till, Е. Мс. Kulloch, L. Siminovitch. Използвахме пет групи мишки, във всяка от която имаше по 20 животни. Прилагахме превантивно 5 поредни дни GSв дози както следва: I група - 30 mg/kgтелесна маса, II група - 20 mg/kg, IIIгрупа - 10 mg/kg, IV група - 5 mg/kgи V - контролна, която поихме с дестилирана вода. На петия ден облъчихме с 10 Gyгама - лъчи, а на осмия ден след облъчването извадихме далаците, на които броихме ендогенни далачни колонии.
• Проследяване на хематологични показатели от периферна кръв: левкоцити, гранулоцити, лимфоцити, тромбоцити при плъхове порода "Вистар" от мъжки пол с телесна маса 150-170 g. GSбе даван пет поредни дни профилактично в ози 5 mg/kgтелесна маса, след което облъчихме с 4 Gyработната и контролната група. Проследихме хематологични показатели в динамика.          Фгоцитарната активност е определена в маркирана по ¹⁴ С 20-часова култура от Echerichiacoliи култивирана в монослой /8/ ¹⁴ С Echenchiacoliбеше получена след инкубиране на бактериална култура в хранителна среда на Тимаков, съдържаща като радиоактивни маркери ¹⁴ С тимин и ¹⁴ С аценин. Прави се изолиране на неутрофилите чрез NH4Cl- изотопичен разтвор, следва трикратно градиентно центрофугиране и измиване на клетъчната суспензия с разтвор на Henk's. Получените неутрофили са със съхранен виталитет. Инкубацията се извършва за 1 час при 37° С в съотношение неутрофили / Echerichtacoli1: 10, след което невключената в монослоя активност се отстранява чрез четирикратно изплакване с физиологичен разтвор. Лизисът на клетките се извършва 0.15 % на натриев лаурил сулфат, прибавя се сцинталационен коктейл и се измерва ?-активността на течно сцинталационен брояч. Фагоцитозата се изчислява в проценти от изходната активност за 1.10⁶ клетки.

РЕЗУЛТАТИ И ОБСЪЖДАНЕ

Работната и контролна групи от по 20 опитни животни. Работната група поихме с GS30 mg/kgтелесна маса пет поредни дни преди и след облъчване с 3 Gy, а контролата поихме с дестилирана вода.

I. Ефект на GSвърху преживяемост на мишки след остро облъчване.

Резултатите от проследяването на преживяемост на мишки показват статистически достоверна разлика при профилактично третираната група на 16"™, 23"™ и 30"^1и ден след облъчването. Това най-вероятно се дължи на три фактора: стимулация на хемопоезата /всички клетъчни редове/, наличието на мощни антиоксиданти като флавоноиди, антоциани, полифенолни киселини и др. и повишената фагоцитарна активност на неутрофилите /30"^ти ден преживелите профилактично третирани животни са 63% ±5.1%, а контролата 33% ±4.5% /.
При терапевтично третираната група статистически достоверна разлика получихме на I6"™¹ ден. Преживелите са 55% ±5.3% за опитната група и 38% ±4.6% за контролата.

II. Проследяване на ендогенни далачни колонии /Е-КОЕд/

При Г^ва група, на която прилагахме GSв дози 40 mg/kgтелесна маса получихме среден брой Е-КОЕд 7.17 ±1.34, II '^ра група 30 mg/kg- 6.57 ±0.83, ПГ^та група 20 mg/kg- 3.29 ±0.41, IV'™ група 10 mg/kg- 1.80±0.33. При контролната група не открихме далачни колонии. Препаратът вероятно или спомага за по- голямото съхранение на стволовите клетки след облъчване или ускорява тяхната пролиферация или модифицира и двата процеса, което води до по-бързо ?възстановяване на кръвотворенето след облъчване./1/

III. Ефект на GSвърху хемопоезата на плъхове порода "Вистар".

Проследихме в динамика кръвни показатели, а имено левкоцити, гранулоцити, лимфоцити и тромбоцити. Поихме опитната група животни с 5 mg/kgтелесна маса с GS, след което облъчихме в гама-облъчвател с 4 източника ⁶⁰Со в дози 4 Gy/екстраполационният коефициент плъхове/ мишки е 0.157 / В първите 10 дни след облъчването левкоцитите на работната група са по- високи от тези на контролата, а на 23'^тия ден разликата е статистически достоверна. Тромбоцитите при третираната група са с по-високи стойности от тези на контролата, с изключение на 5"^тил ден, Тук не откриваме статистически достоверна разлика.

ИЗСЛЕДВАНЕ НА "КРЪВЕН ЗДРАВЕЦ"'

ПЪРВА ГРУПА - LEU. OR, L.Y,

IV. Ефект на GSвърху фагоцитарната активност на неутрофили.

Неутрофилните гранулоцити са едни от най-чувствителните на йонизиращо облъчване кръвни клетки. Приложеният радиоизотопен метод ни дава инрегрална оценка за функционалното състояние на фагоцитиращите неутрофили.

GSпоказа, прилаган в профилактично-терапевтична схема, статистически достоверна разлика. Данните за контролата са 7.21% ±1.53%, работната група, третирана с GS10.67% ±1.61%.

Получените резултати ни дават основание да смятаме, че GSима категорично стимулиращо действие върху фагоцитиращите неутрофили.

V. Ефект на GSпо отношение на Т-лимфоцитите при онкоболни, подложени на лъчетерапия.

Прилагането на GSстимулира селективно Т-лимфоцитната популация, изразена в статистически достоверни граници при сравнение с контролната група. Наблюдаваните промени в процентния дял на общите лимфоцити не показаха корелация с динамика в определена Т-лимфоцитна субпопулация. Съотношението между Т-хелпери/индюсери и Т-цитотоксични/супресори останаха постоянни. Анализът и на останалите лимфоцитни субпопулации - общи: В-лимфоцити, NK-клетки не показаха статистически значими различия. На този етап от проучването ефектът от приложението на GSсе отчита като положителен. Запазването на Т-лимфоцитната популация, която е отговорна за клетъчния имунен отговор при окологичните болни, е от особено значение.

ИЗВОДИ

1. GRповишава значително преживяемостта при мишки облъчени с летални дози;
2. GRповлиява положително хемопоезата при плъхове, спомага за по-бързото възстановяване на показателите в периферната кръв;
3. GRповлиява значимо количеството на ендогенните далачни колонии /Е- КОЕд/;
4. GRповлиява положително функцията на неутророфилната популация. ФА на третираната група с GSе статистически достоверно по-висока в сравнение с контролната група.
5. Приложението на GSпри онкологично болни, подложени на лъчетерапия показа запазване на Т-лимфоцитната популация, което определя ползата от съпътстващото му приложение в този случай. Тези резултати определят и възможността GSда бъде прилаган профилактично при контингенти, работещи в среда с йонизиращи лъчения.